Determinación de Hemoglobina

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA

Principio:

La Hemoglobina  normal del adulto (Hemoglobina A1 es el tipo que predomina).

Cosiste en 4 grupos hem que contienen hierro y 4 cadenas polipeptídicas: 2 cadenas alfa y 2 beta que contienen 141 y 146 aminoácidos respectivamente.

Fundamento:

La Hemoglobina se sintetiza durante la mayor parte del proceso de maduración de los eritrocitos. Cerca del 65% de la Hemoglobina celular se sintetiza antes de la pérdida del núcleo y el 35% restante lo hace en la etapa temprana de Reticulocitos. Los principales componentes de la Hemoglobina son: El grupo Hem y la Globina. La médula ósea roja y el Hígado son los principales productores del Hem. La fracción hem completa consiste en 4 anillos pirrólicos conectados en un anillo tetrapirrólico más grande, mediante puentes metilo.

La Hemoglobina se puede cuantificar en el laboratorio por métodos colorimétricos, como el de la “Cianometahemoglobina” utilizando el reactivo de Drabkin, el cual contiene bicarbonato de potasio a una concentración tal que los eritrocitos al contacto con esta solución explotan, dejando libre la Hemoglobina, la cual ya libre se oxida por la acción del ferrocianuro de potasio presente en el reactivo, a esta Hemoglobina oxidada se le conoce como Metahemoglobina, la cual se une al Cianuro de potasio del reactivo de Drabkin produciendo la CIANOMETAHEMOGLOBINA, la cual produce una intensidad de color proporcional a la cantidad de Hemoglobina y la cual se puede medir en un Espectrofotómetro.

La sangre se diluye en líquido de Drabkin, el cual hemoliza los hematíes y convierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemoglobina). La solución que se produce se lee por medio de un espectrofotómetro o fotocolorímetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre.

 Materiales y reactivos

 Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.

 Pipetas:

 Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 0,02 mL, con tubo de goma y boquilla.

 Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

 Tubos de ensayo.

 Reactivo de Drabkin para dilución.

 Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1  litro de agua destilada. Si se dispone de una balanza analítica la  preparación se puede hacer en el laboratorio. Esta solución se puede conservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro. Deséchese si se enturbia.

El líquido de Drabkin no debe enfriarse demasiado, pues puede causar una decoloración con reducción del ferrocianuro.

Referencia para cianometahemoglobina (estandarizada):

Esta solución se puede adquirir en el comercio o en un laboratorio de referencia.

En las soluciones de referencia comerciales casi siempre indica la concentración en miligramos por 100 mL (generalmente en mg%).

Técnica:

1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P). Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).

2.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra. Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta y se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.

3.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza parafilm para tapar los tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO)

4.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción. Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se procede a realizar la lectura.

5.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

SUSTANCIAS	BLANCO	SOLN    STÁNDAR	PROBLEMA
Reactivo de Drabkin	5.0 ml	5.0 ml	5.0 ml
Agua Destilada	0.02 ml
Solución Estándar		0.02 ml
Sangre			0.02 ml

MEDICIÓN EN EL ESPECTROFOTÓMETRO.

MILTON ROY MODELO SPECTRONIC 1201

Medición de Transmitancia:

1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después  seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>.  Aparecerá en la pantalla el valor numérico.

2.-Presine < %T> para Transmitancia.

     Aparecerá en la pantalla “T”.

3.-Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.

4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.

 Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.

5.-Si desea imprimir, oprima <PRINT> para avance de papel y/o una segunda vez para la impresión en el papel del espectrofotómetro o <SECND REMOTE>  para mandar a un dispositivo externo (a la computadora).

6.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y  guárdela)

7.-Si no va usar más el aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar trabajando, elija el modo de trabajo siguiente y continúe.

MEDICIÓN EN EL ESPECTROFOTÓMETRO.

COLEMAN

Medición de Transmitancia

1.- Se enciende el  Espectrofotómetro 15 minutos antes de usar.

2.- Seleccionar la longitud de onda de  540 nm.

3.- Calibrar a cero de Absorbancia o 100 % de Transmitancia  con el blanco reactivo, se coloca el  blanco en la cubeta, después en la rejilla y se cierra y se calibra con el botón.

4.- Colocar las soluciones de cada paciente  y la del St en la cubeta y leer su % T, limpiando la cubeta al pasar de un paciente a otro y verificar la calibración a cero con blanco.

5.- Al terminar apague, cubra y Espectrofotómetro,  y enjuague cubetas

Resultados

La  absorbancia del problema debe ser comparada en la curva patrón para encontrar a que concentración de hemoglobina o utilizar la fórmula para cálculos de concentraciones, expresándose en g/100 mL

Cálculos.

Valores de referencia:

Niños al nacer 13,6 - 19,6 g/dL

Niños de 1 año 11,3 - 13,0 g/dL

Niños de 10 -12 años 11,5 - 14,8 g/dL

Mujeres 11,5 - 16,5 g/dL

Hombres 14,0 - 18,0 g/dL

IMÁGENES DE LA PRÁCTICA