Determinación de Hemoglobina

DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA

Objetivo:

Determinar cuantos gr de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnostico clínico ya que se pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal de Hemoglobina.

Fundamento:

La hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de oxígeno y dióxido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxígeno.

Una molécula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipepticas (unión de aminoácidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un átomo de fe en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de una de las cadenas de polipepticos. Localizando cerca la superficie de la molécula, el HEM se combina de forma reversible con una molécula de oxigeno y dióxido de carbono. Este grupo HEM es el responsable del del color rojo de la hemoglobina (hb).

La parte proteica o globina tiene 4 cadenas polipeptidicas que se denominan con las letras α, β, γ, δ. Existe una cadena mas la ε que esta presente durante los 3 primeros meses de vida se diferencian unas de las otras en el numero o posición (de los aminoácidos de los que están compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de hb. en el ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:

Hemoglobina A: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas β en un adulto normal corresponde a mas del 95% del total.

Hemoglobina A´: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas δ en un adulto sano esta en porción menor de 3%.

Hemoglobina F (fetal): consa de 2 cadenas α y 2 cadenas γ. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinaidad por el oxigeno.

Hemoglobina Gower: consa de 2 cadenas α y 2 cadenas ε. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.

Algunos datos se obtiene exmainando a simple vista una muestra de sangre. Un aspecto normal del suero o del plasma revela que el pigmento esta en los glóbulos rojos. Si se agita en una sangre total normal en el aire durante 15 min. Adquere un color rojo claro por convertir la Hb en oxihemoglobina.

La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la intoxicación por CO. El color es chocolate en la metahemoglobulemia y la banda malvada en alsulfohemoglobulemia.

Las distintas Hb tienen espectros de absorción características a las que determina en un espectofotometro. La identificación de difrenetes formas de la Hbcon la determinación de sus espectros de absorción puede hacerse de una manera sencilla  

Material y Equipo:

·         Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.

·          Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

·         Pipeta semiautomática

·          Tubos de ensayo.

·         Cubetas cuadradas.

·         Gradilla

·         gasa

Reactivos:

·         EDTA

·         Reactivo Drabkin

·         Ferrocianuro de potasio

·         Cianuro de potasio

·         Bicarbonato de potasio

·         Solución estándar de cianometahemoglobina

Reactivos biológicos:

·         Sangre venosa con EDTA.

Técnica:

1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P).

2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).

3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.

4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta.

5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.

6.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza parafilm para tapar los tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO).

7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción.

8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.

9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

Antes de hacer la medición con el espectrofotómetro hacer el siguiente procedimiento

PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:

Medición de Transmitancia:

1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después  seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>.  Aparecerá en la pantalla el valor numérico.

2.-Presine < %T> para Transmitancia.

     Aparecerá en la pantalla “T”.

3.-Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.

4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.

 Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.

5.-Si desea imprimir, oprima <PRINT> para avance de papel y/o una segunda vez para la impresión en el papel del espectrofotómetro o <SECND REMOTE>  para mandar a un dispositivo externo (a la computadora).

6.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y  guárdela).

7.- para entender lo hablado ver la imagen siguiente:

8.-Si no va usar más el aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar trabajando, elija el modo de trabajo siguiente y continúe.

Imágenes del espectro:

Cálculos:

.461/.472 x 15 = 14.65

Rango:

normal ya que era la muestra de una mujer

Cálculos:

Hb total = concentración de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).

en espectofotometro se aplica la siguiente formula:

muestra/ estandar x 15 = Hb

Valores de referencia:

Niños al nacer…………………………….. 13,6 - 19,6 g/dL

Niños de 1 año…………………………..... 11,3 - 13,0 g/dL

Niños de 10 -12 años……………………... 11,5 - 14,8 g/dL

Mujeres……………………………………... 11,5 - 16,5 g/dL

Hombres……………………………………. 14,0 - 18,0 g/dL

Observaciones:

Al hacer la práctica notamos que para determinar este volumen que existe de Hb circulante en la sangre es fácil y sencillo de sacar ya que a la hora de meterlo al espectrofotómetro prácticamente nos dice todo solo hay que sacar el resultado haciendo la operación básica que ya nombramos anteriormente.

Los exámenes de laboratorio pueden realizarse por muchas razones, como investigación rutinaria de salud o sospecha de enfermedad o de toxicidad. También pueden ser utilizados para determinar si la efectividad de un medicamento mejora o empeora. Los exámenes pueden medir el éxito o fracaso de un tratamiento. Pueden ser solicitados por razones médicas o legales. Las siguientes son posibles razones por las que este examen puede realizarse:

·                     Acidosis láctica

·                     Anemia de células falciformes

·                     Anemia por deficiencia de hierro

·                     Embolia grasa

Conclusiones:

Existen varios factores para determinar cuándo y con qué frecuencia se pueden realizar los exámenes. Su duración puede depender de los resultados o terminación de otros exámenes, procedimientos o tratamientos. Los exámenes pueden ser realizados inmediatamente en una emergencia o pueden ser demorados conforme una condición es tratada o monitoreada. Se puede sugerir un examen o llegar a ser necesario cuando aparecen ciertos signos o síntomas.

Debido a cambios de las funciones naturales del organismo durante el día, los exámenes pueden ser realizados en una determinada hora. Si usted se ha preparado para este examen con cambios en la ingesta de comida o líquidos, los exámenes pueden ser realizados de acuerdo con estos cambios. Los intervalos para la realización de los exámenes pueden basarse en el aumento o disminución de los niveles de medicamentos, drogas u otras sustancias en el organismo.

La edad o el género de las personas pueden influir en la fecha y la frecuencia con que se requiere un examen. Las condiciones crónicas o progresivas pueden necesitar un monitoreo continuo mediante exámenes. Ciertos exámenes pueden ser repetidos para obtener una serie de resultados o para confirmar o refutar resultados. Las veces que deban realizarse los exámenes y su frecuencia varían dependiendo si se llevan a cabo por razones profesionales o legales.

Referencias:

·         Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas